解析データの
見方について
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- 解析データの見方について
概要
レパトア解析の結果は、TCRやBCRにおいて遺伝子別にそれぞれ出力されるため、例えば血液検体が1つであったとしても、TCR α鎖、TCR β鎖の解析を行った場合には、ふたつの結果が得られます。また解析結果をまとめたレポートファイル（Excel）は、動物種および遺伝子別に用意されています。これはV遺伝子およびJ遺伝子が、例えば TCR α 鎖とTCR β鎖では異なるためです。
一方、BCR遺伝子については、重鎖（H鎖）としてIgM、IgG、IgA、IgD、IgEがそれぞれ異なる特異的プライマーによって増幅され、別々のレポートとして得られるものの、これらはH鎖の定常領域がクラススイッチによって変化したものであり、V遺伝子およびJ遺伝子のセットは同じ配列となります。このため、レポートファイルの種類はH鎖として共通のシートとなります。なお、軽鎖（L鎖）にはIgL、IgKの2種類がありますが、これらは異なるV遺伝子およびJ遺伝子のセットとなるため、レポートファイルは異なるシートとなります。以下に、各動物種別に得られる解析結果の種類をまとめました。
レポートファイルの説明
以下にレポートファイルの例を示します。
- レポート種類
- 動物種、遺伝子種類に対応した解析シート
- レポートのバージョン
- レポート生成日、検体ID
- Date of report：解析ソフトによってレポートが生成された日付
- Project ID：案件番号
- Sample ID：検体ID + 解析遺伝子
TCR α、β、γ、δ：a、b、g、d
BCR IgM、IgG、IgA、IgD、IgE、IgL、IgK：M、G、A、D、E、L、K
- シーケンス情報
- Total reads：次世代シーケンサーによる解析で得られたリード数
- Assigned reads：解析ソフトでTCR 遺伝子として判定されたリード数
- In frame reads：CDR3 領域がアミノ酸配列に変換可能な（機能的な）リード数
- Unique reads：In frame reads のうち、固有の組み合わせを持つリード数
- In frame / Unique：Unique read が持つInframe read 数の平均値
- 多様性指数
- レパトアの多様性の程度を4 種類の多様性指数で表示しています（数字が大きいほど多様性が大きいと評価します）。
- Shannon-Weaver index H’：シャノン指数
頻度の低いリード（リード数の少ないユニークリード）も考慮するため、検体のレパトアの豊富さに対して感度が高い特徴があります。レパトアの多様性を表す指数としては適正です。一方、その特性により、クローナリティーが高い検体では感度が低下する可能性があります。 - Inv. Simpson’s index 1/λ：シンプソン指数（逆数）
頻度の高いリード（リード数の多いユニークリード）を強調する特徴があり、クローナリティーが高い検体の評価に適しています。一方、レパトアの豊富さに対して感度が低下する可能性があります。 - Pielou’s evenness：ピールー指数
evenness（均など性）を強調し、シャノン指数やシンプソン指数（逆数）のような特異性や多様性にフォーカスしない特徴があります。安定的な評価系であるため、数値的なデータの差が出にくい可能性があります。 - DE50（Diversity Evenness score）
クローナリティー（クローンの程度）を示す指標で、上位ランキングのユニークリードからIn frame reads を足し合わせ、50％のIn frame reads を占めるユニークリード数の割合を評価します。
- レパトア解析結果 2D グラフ
- 検体のレパトアで、V 遺伝子、Ｄ遺伝子、J 遺伝子、Ｃ遺伝子（判定可能な場合のみ）の頻度を集計し、グラフ化したものです。
- 横軸に遺伝子名、縦軸に頻度（％表示、合計値は100％、レンジは変動する）を表示します。
- レパトア解析結果 3D グラフ
- 検体のレパトアで、V 遺伝子、J 遺伝子の頻度を集計し、グラフ化したものです。
- 2D グラフとは異なり、V-J 遺伝子の組み合わせが一致するリードを積み重ねたグラフとなります。
- 横軸にＪ遺伝子、奥行きにＶ遺伝子、縦軸に頻度（% 表示、合計値は100％、レンジは変動する）を表示します。
- Unique read ランキング Top 50
- V-J-CDR3 アミノ酸配列が同一のIn frame read を集計し、Unique read の使用頻度を表示します。
- 左から「ランキング」、「V 遺伝子」、「Ｊ遺伝子」、「CDR3 アミノ酸配列」、「該当する In frame read数」、「In frame read 中の使用頻度（%）」を示します。
- 50 位以降のリードについては、同じExcelファイルのタブ「back_data」に、すべての集計結果（out of frame も含む）が格納されています。
評価を行ううえで注意すべき点
細胞数が少ない検体、RNA 濃度が薄い、品質が低下している検体、T 細胞およびB 細胞の存在量が少ないと想定される組織検体では、レパトア（多様性）が始めから少ない場合があるため、比較対象の条件を踏まえたうえで、クローナリティーについて言及する必要があります。
効率よくレパトア解析結果を読みほどくコツ
1 まずは3D グラフで何か特徴があるか確認する
- そのピークはほかの検体でも高いですか、そうではないですか? グラフの傾向は類似しますか？
- 共通のピークがあれば、特異的に活性化しているクローンを追跡することができます。
2 ランキングを見て1％以上のリードをピックアップ
- 特異的な反応を起こしているクローンの候補となりえます。
- 検体にもよりますが、マウスTCR α鎖では、iNKT細胞（自然免疫系と獲得免疫系の中間に位置する特殊なT 細胞）が数％レベルで、しばしば検出されます。
3 多様性指数は大きいですか：小さいですか？
- 検体間比較において、客観的な数値として、多様性やクローナリティーを評価できます。
補足資料の説明
レパトア解析において、大量のシーケンスデータから得られたレパトアの集計結果は、検体別としてレポートファイルに集約されているものの、検体間での比較を手作業で行うことは、過酷としか言えません。そのため、複数検体で同じ解析遺伝子を依頼された先生方には、検体間のリード比較を容易にするために、以下の補足資料を含めて報告しています。
- シーケンスQV スコア
- 検体間比較（シーケンス情報、多様性指数）
- 検体間比較（Unique read 共通性）
- データベース更新にともなう遺伝子名の対応表
補足資料1：シーケンスQV スコア
- 各検体のシーケンスリードの品質（R1、R2）を評価することができます。
- QV20 を下回る検体（品質が低下している検体）については、結果を考慮する必要があります。
※Miseq では塩基配列を両側から読むため、R1（表側）、R2（裏側）のデータが得られます。裏側は品質が低下する傾向があるため、R1 側でJ 遺伝子とCDR3 アミノ酸配列、R2 側でV 遺伝子を判定します。各検体のExcelレポートでは、レパトア解析により自動的にR1、R2 から得られた情報を結合し集計します。
補足資料2：検体間比較（シーケンス情報、多様性指数）
- 個別検体のレポートファイルを開くことなく、解析結果のシーケンス情報や多様性指数を確認できるため、データの抜粋や統計処理の際に、効率よく作業が進められます。
補足資料3：検体間比較（Unique read 共通性）
- 個別検体のファイルを開くことなく、特定のユニークリードについて効率よく検索ができます。
- 各検体間で共通するユニークリードが一覧になっているため、特定ユニークリードにおける経時的変化の評価がしやすいです。
- 評価の注意点としては、集計表自体は「リード数」で表記されているため、レパトアの存在頻度（%）を見る際は、各検体の総In frame read 数を分母として、割算した値を取得し、評価を行います。
補足資料4：データベース更新にともなう遺伝子名の対応表
- 最新のIMGT 遺伝子名表記および分類に対応するため、レパトア解析に使用する当社データベースを定期的に確認、更新し、より正確な解析結果が得られるように反映させています。
- レパトア解析実験そのものに変化はないため、過去に実施したシーケンスデータを元にして、再解析が可能です。
- 経時的な解析を実施されている先生方については、無償にて再解析を実施いたします。